开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 本课题的研究背景
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
自2013年1月首次报道利用CRISPR/CAS系统可以对哺乳动物细胞进行基因组的改造以来，CRISPR/CAS系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。本课题研究的就是利用GenCRISPR技术敲除HEK293细胞中的HSP90B1基因。HEK293细胞来源于人体肾脏的上皮细胞，贴壁生长，HEK293细胞极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
HEPA12A、HSP90B1、HSPA4、HSPA5和HSPA6都属于上调休克蛋白，在肿瘤组织与HBV相关肝癌早期不良预后相关。HSP90B1是一种编码基因，该基因编码一个家庭的三磷酸腺苷（ATP）的一个成员的代谢分子伴侣和折叠蛋白的稳定作用。编码的蛋白位于黑素和内质网，这种蛋白质的表达与多种致病状态相关，也被称为Asecgp、gp96、肝硬化、GRP94、hel35hel-s-125m，包括肿瘤的形成。本课题主要研究如何利用GenCRISPR技术敲除HSP90B1基因，并探究该方法的优越性及前景。
- GenCRISPR技术的主要实验方法
CRISPR/CAS9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最新出现的一种基因敲除技术，由RNA指导Cas核酸酶进行基因定位修饰。CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌针对外源基因进化而来的获得性免疫防御机制。在该系统中，crRNA与tracrRNA结合形成的复合物能特异性识别靶基因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因组DNA进行修饰的目的。具体方法如下：
1.确定待敲除基因的靶位点
根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5rsquo;和3rsquo;侧翼序列。
2、 设计识别靶位点的一对DNA Oligos
确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（http://crispr.mit.edu/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此， sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos（同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
3、 构建可表达sgRNA的质粒
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