1.课题来源：自拟课题
2.研究目的：筛选具有抗肿瘤作用和免疫增强作用的的高效IDO抑制剂并且研究其药理活性。
3.研究内容：吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）是一种免疫调节酶，能够抑制效应T细胞和自然杀伤(natural killer NK)细胞的增殖与功能，并且与调节性T细胞形成了正反馈调节环路，抑制微环境内的抗肿瘤免疫应答，在肿瘤的免疫逃逸中发挥着重要作用。肿瘤细胞自身可以表达IDO，还能够募集表达IDO的树突状细胞(dendritic cells, DC)进入肿瘤微环境，在肿瘤浸润组织和引流淋巴结中都可以发现高水平表达的IDO 。基于IDO在肿瘤免疫抑制中的作用，抑制IDO可提高化疗药物的疗效，减少化疗药物的用量。因此，IDO成为一个具有良好前景的的肿瘤治疗靶点，IDO抑制剂的研究与开发逐渐受到重视，本课题拟采用分子生物学方法评价某些IDO抑制剂的抑制活性并筛选出具有免疫增强作用的高效IDO抑制剂，研究其药理活性。
4.研究手段：
①流式细胞术
（1）在每个流式上样管中加入100ul准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。（2）按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原（CD3、CD25）。（3）用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer或预冷的PBS洗涤细胞。（4）旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization），并再次旋涡混匀。（5）避光4℃孵育30-60分钟。（6）加入2ml Permeabilization Buffer（ebioscience，目录号00-8333）工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。（7）重复第5步操作洗涤细胞。（8）加入稀释好的2%（2ul）的正常大鼠血清（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释）100ul，在避光4℃孵育15分钟。（9）封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记FOXP3抗体（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释）20ul，避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。（10）加入2ml Permeabilization Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。（11）重复上一步洗涤细胞。（12）用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。
②免疫印迹法
（1）收细胞： 2500 rpm离心5min收集jurkat细胞。
（2）提蛋白：用冷PBS洗两次，尽量弃去残余的PBS。用适量体积冷细胞裂解液或者磷酸化裂解液重悬细胞，冰上放置50 min，充分裂解细胞。将细胞裂解液4℃ 13000 rpm 离心30 min，上清液为抽取的总蛋白。用BCA法测定蛋白含量，并稀释成相同的浓度。然后将同等总蛋白量的不同处理样品按1:3与4 loading buffer混匀，沸水浴变性5 min后，于-20℃保存。
（3）制胶和电泳：制备8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V浓缩胶，120 V分离胶，2.5～3 h。
