一、拟研究或解决的问题1.铁氧还蛋白还原酶及铁氧还蛋白融合蛋白设计,linker的设计2.电子传递系统融合蛋白目的片段的拼接和表达载体的构建3.电子传递系统融合蛋白的表达及活性研究二、采用的研究手段1.设计并利用linker将CYP105D1同源的铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白连接2.将铁氧还蛋白与铁氧还蛋白还原酶融合蛋白克隆至表达质粒pET22b的T7启动子之下,构建表达电子传递系统融合蛋白的质粒。
3.将质粒转化至E.coli BL21(DE3)或C43(DE3)中进行表达,并通过对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及加入时间、震荡转速等条件控制,优化其表达。
进而将CYP105D1与融合蛋白soyB-Fdr1共表达,初步研究工程菌株对左旋四氢巴马汀的转化水平三、文献综述细胞色素P450(酶系)是一类被广泛研究的血红素蛋白超家族,其可介导多种氧化反应[1],例如N-,O-和S-脱烷基化,磺酰氧化,环氧化,脱氨,脱硫,脱卤,过氧化和N-氧化物还原等。
它们分布广泛,在古细菌、细菌和真核生物中均有发现,并且参与了包括异生物氧化,类固醇合成,细胞信号传导过程中脂质介质合成,大量复杂生物大分子诸如聚酮抗生素合成等生物过程,还可以参与顽固有机分子的生物转化,使其变成可以被生物吸收利用的碳源[2-5]。
P450对人体生理学同样有着重要的作用,因其可在温和条件下介导区域和立体选择性氧化,它提供了一条更加清洁也更加环保的路线来合成许多具有高科研价值的化合物,也引起了生物技术领域研究者的兴趣[6-8]。
细胞色素P450根据电子传递系统的差别,可将其分为多种类别。
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最主要也是最常见的是I类和II类。
I类电子传递系统主要存在于原核生物中。
电子从NAD(P)H传递到含有FAD辅基的铁氧还蛋白还原酶上,然后铁氧还蛋白还原酶把电子传递到铁氧还蛋白,最后由铁氧还蛋白向P450传递电子,完成催化反应。
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