拟研究的内容：
本课题拟将HB-32抗体改造成重链C末端带有LPXTG标签的抗体，便于后续ADC药物的研究。
采用的研究手段：
在H3L2-H-pMH3和Be-H-pMH3载体中添加LPXTG标签，将改造后的重链表达载体及未改造的轻链表达载体导入HEK293瞬时表达、纯化，得到重链C末端有LPXTG标签的HB-32-LG抗体。
国内外文献综述：
抗体偶联药物（ADC）是指抗体与小分子细胞毒性药物通过化学键偶联形成的具有高特异性和高抗肿瘤活性的靶向抗肿瘤药物。在传统的肿瘤治疗方法中，有抗体疗法和小分子毒性药物疗法。抗肿瘤抗体可以特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原，具有高度的专一性。小分子细胞毒性药物可通过破坏DNA、抑制蛋白合成、阻止细胞分裂等对肿瘤细胞进行杀伤，具有高效的抗肿瘤活性。小分子细胞毒性药物虽然活性高，但是缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞起到杀伤作用【1】。抗体偶联药物结合了两种疗法的优点。抗体偶联药物利用抗体与抗原结合的特异性，能够将偶联在抗体上的小分子药物精准地运送到肿瘤细胞，待肿瘤细胞內吞ADCs之后，毒性小分子释放，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，从而达到抑制肿瘤细胞生长，治疗肿瘤的效果。双特异性抗体相较于单克隆抗体，双特异性抗体增加了一个特异性抗体结合位点，具备更强的特异性、靶向性和抗肿瘤活性，同时可以降低脱靶毒性，增加细胞内化速度。随着ADC药物的发展，双特异性抗体偶联药物作为一种新的疗法，近年来成为抗肿瘤药物的研究热点。
目前大多数抗体偶联药物所采用的接头可以分为两大类: 可切除接头与不可切除接头。可切除接头依赖抗体偶联药物进入细胞内后接头本身的降解获得游离的药物, 包括腙键接头和二硫键接头。不可切除接头则需要相应的酶降解接头或偶联物中的抗体部分来释放药物, 如二肽接头和硫醚接头。与可切除接头相比, 不可切除接头在血浆中稳定性更好, 其半衰期更长。通常药物与抗体的偶联是通过抗体上赖氨酸残基或链间二硫键还原产生的半胱氨酸残基实现的, 具有较大的异质性【2】。定点偶联技术提高了ADCs的均一性，包括半胱氨酸突变【3】、非天然氨基酸【4】、硒代半胱氨酸【5】和酶解偶联法【6】等。
近年来，人们发现从金黄色葡萄球菌中获取的Sortase A，可以用于修饰蛋白。Sortase A可以特异性结合蛋白质C末端的LPXTG序列 (X是任意氨基酸) , 切断苏氨酸和甘氨酸之间的肽键, 而后与N-端含有甘氨酸残基的蛋白质或多肽末端连接形成肽键【7】。Roger R. Beerli【8】提出了一个基于金黄色葡萄球菌Sortase A介导的转肽酶解反应的酶结合方法，用于ADCs的研究。即分别于免疫球蛋白重链(IgH)和轻链(IgL)的C端添加Sortase A识别基序LPETG，分子微管蛋白聚合抑制剂一甲胺基化抑制素E (MMAE)和美登素添加五甘氨酸肽，通过Sortase A酶的转肽反应完成抗体与毒性药物的连接。实验表明Sortase A酶介导的转肽反应是一种普遍适应的制备ADCs的方法。
因此，本课题为了后续ADCs药物的研究，可以通过Sortase A酶介导的转肽法将小分子药物连接到抗体上，将制备含LPXTG序列的双特异性抗体。
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