一、国内外发展概况及立题依据
手性是自然界中普遍存在的一种现象，不同对映体往往具有不同的药理、毒性。所以手性拆分与我们的生活息息相关，具有十分重要的意义。高效液相色谱整体柱具有制备相对简单、原料易得以及聚合组分在一定范围内可调节的优点，是近年来得到迅速发展的新型色谱柱，将蛋白质做为其手性固定相，可以对手性药物进行有效的分离，其制备方法分为动态物理吸附和化学键合2种，固定相上蛋白质的吸附量或者是键合量与色谱柱的柱效和分离能力密切相关，因此建立准确、快速检验色谱柱基质吸附或者键合蛋白质含量的方法具有一定的意义。
在许多蛋白质研究的领域中，用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。考马斯亮蓝法在许多实验中已成为首选方法用来定量的检测蛋白浓度。与传统的方法相比，该法更易操作，更快，更灵敏。此外，它受其他一些试剂和非蛋白成分干扰也较小。考马斯亮蓝溶液采用乙醇溶解，磷酸调节PH。乙醇溶液的浓度直接影响考马斯亮蓝的溶解性、溶液的极性，磷酸浓度直接影响考马斯亮蓝分子在整个溶液中的存在形式，从而影响与蛋白质间的疏水结合，引起吸光值的漂移。因此，研究各溶剂对考马斯亮蓝的影响变化有很重要的意义。
考马斯亮蓝法检测原理是基于染料考马斯亮蓝和蛋白质之间形成的特异性结合。考马斯亮蓝G-250存在着3种不同的颜色形式，红色，绿色和蓝色,考马斯亮蓝G-250在酸性条件下呈棕红色，绿色为过渡色，该染料可以自由存在于4种不同的离子形式中，相比之下，染料更多的以阴离子形式与蛋白质结合，且结合后显蓝色，在590nm左右具有最大吸收，因此通过定量测定染料的蓝色离子的量就可以算出蛋白质的量。这通常可以在595nm处测定吸光度获得。蛋白质与考马斯亮蓝G250的特异性结合可能会使这些蓝色染料的离子形式的最大吸收波长从590nm向620nm转移,因此在测量前我们应该先确定在590nm至620nm之间有没有更大的吸收波长。不过，在通常的pH值下，为了简单起见，作为染料-蛋白复合物的折中我们经常以595nm作为测量波长。这种染料最容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰键结合,这种特异性可导致对不同的蛋白质检测时结果差异较大。这是此方法的主要缺陷。并且该染料不与单体精氨酸、赖氨酸以及相对分子质量小于3000的多肽结合，许多肽类激素和其他一些重要的活性肽也在这一范围内，所以该考马斯亮蓝法不适用于对这些化合物的定量测定。用来待测定的蛋白质和用来建构校准曲线的蛋白质应该用同一种，通常牛血清白蛋白（BSA）是常用的蛋白质标准品。因为它价格便宜而且质量也比较纯净，更重要的是可以将待测样品的测量结果直接与它的标准曲线进行比较。
二、拟研究和解决的问题
近年来，手性药物对映体的拆分已经引起了世界各国的广泛关注，发展手性药物的拆分技术已经成为热门的研究话题。手性药物的拆分需要手性选择剂提供合适的拆分环境。随着对手性选择剂研究的不断深入，各种手性选择剂不断地被应用。常用的手性选择剂有环糊精、多糖、抗生素、蛋白质等。其中，蛋白质以其分离手性药物范围宽、作用位点多、分离效率高等优势获得了极大关注。蛋白质作为手性选择剂主要被应用于两个方面，一是作为流动相添加剂，二是作为手性固定相。由于蛋白质价格昂贵，背景吸收高，因此将蛋白质键合在柱床上作为手性固定相成为研究热点。
高效液相色谱整体柱具有制备相对简单、原料易得以及聚合组分在一定范围内可调节的优点，是近年来得到迅速发展的新型色谱柱，将蛋白质作为其手性固定相，可以对手性药物进行有效的分离。然而蛋白质的键合量是手性分离一个重要的参数，键合量的多少直接影响着分离的好坏。所以，对于蛋白类高效液相手性整体柱键载量的研究有着重要的意义。这也是本课题所要解决的一个最重要的问题。
三、研究内容及方法
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