文献综述
在细胞生长、分化、发育、增殖、衰老和凋亡等重要过程中，都需要极其精密和有序的调控方式，从而保证各种基因在时间和空间上的正确表达。在特定的时间和空间条件下，基因的选择性表达使细胞的形态结构和生理功能产生差异，并完成细胞分化和生物体的个体发育。基因的激活或抑制，以及基因表达量的多少都影响着细胞的功能和生命体的健康。因此，基于重组DNA技术来精确调控靶基因，使之能够准确、持续并且适时、适量地表达，是进行基因功能研究以及转基因动物、基因治疗等研究的重要领域[1]。
历史上最早的基因敲除小鼠模型是利用同源重组技术制备基因敲除小鼠ES细胞系，进一步通过囊胚注射制备基因敲除小鼠。但这种方式具有复杂、耗时、成功率低等缺点[2,3]。近年来新兴的CRISPR/Cas9系统来源于简单的细菌免疫系统，经过人为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑[4]。该系统能够介导RNA导向的DNA识别及编辑，使用一段序列特异性单链向导RNA分子(single-guide RNA , sgRNA)引导核酸内切酶到达相应靶点处，完成基因组的编辑与修饰[5]。 CRISPR/Cas9作为最新的基因组编辑技术，最直接的应用就是对靶基因进行精确的编辑。靶向目的基因的sgRNA和Cas9核酸酶在真核细胞内共表达，sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别靶基因序列并进行切割产生双链末端断裂DNA，引发胞内HDR或者NHEJ DNA修复途径。当细胞内转有目的基因同源臂的外源DNA时，可以通过HDR途径实现外源基因的敲入[6]。
尽管目前的试验证据发现，CRISPR/Cas9系统存在脱靶效应较高的问题，但由于该系统只需设计sgRNA就可实现对靶基因进行调控，因此相对其他基因操作系统依然存在诸多优势。相比于ZFNs和TALENs系统，它有着无可比拟的优点。首先，CRISPR/Cas9系统的可操作性更强。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR/Cas9进行编辑的位置(PAM序列)，几乎可以对所有基因进行编辑[7]；其次，CRISPR/Cas9系统更具有可控性。例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的NHEJ造成的染色体变异风险;第三，CRISPR/Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何分子生物学实验室都可以开展。正是这些优势，使其成为科学界的新宠[8]。通过将编码Caas9或sgRNA的基因都设计成诱导型启动子控制的载体，可以通过诱导Cas9-sgRNA表达使靶基因沉默，且其效应能具有可逆性[9]。
人类IL-10基因位于1号染色体，包括5个外显子。 IL-10蛋白由2个相同的亚基组成，每个亚基含178氨基酸。IL-10受体(IL-l0R)为异四聚体，由两个IL-I0RI与两个IL-10R2组成。IL-10与IL-l0R受体结合后可激活信号传导与转录激活因子一3 (STAT3)，后者可调控多种基因的表达[10,11]。基于表达IL-10报告基因小鼠的研究表明IL-10主要由T淋巴细胞产生，少量由单核细胞产生[12]。IL-10也可由肥大细胞、上皮细胞及多种肿瘤细胞产生。IL-10在调节肿瘤免疫、炎症反应及自身免疫反应中具有多重作用。IL-10可阻断NF-KB活性，抑制巨噬细胞与Thl细胞促炎症因子IFN -gamma;,IL-2,IL-3,TNF -alpha;与GM - CSF的表达[13]。
目前，肠炎性疾病仍是世界性重大难题。IL17和IL10是新近发现的Th17及Treg细胞分泌的细胞因子，前者在多种炎症性疾病中发挥免疫致炎作用，后者则具有广泛的免疫抑制作用，有研究发现这两种细胞因子亦在IBD的发病中起作用，但具体机制尚不明确。有研究结果显示，IL-10在实验性末端回肠炎的急性炎症期明显下降，而在慢性期有所回升，说明IL-10在炎症过程中起免疫调节作用，并且收到多种因素的影响。因为在实验性末端回肠炎急性炎症期，多种细胞因子活性较活跃，可能对IL-10具有较明显的抑制作用。在实验性末端回肠炎的慢性炎症期，其表达水平随着炎性活性程度减弱而回升，说明其在组织炎症过程中具有调节作用并对实验性末端回肠炎的组织损伤可能有一定的保护作用[14]。为研究包含末端回肠炎在内的各种肠炎的发病机制及探索新的治疗药物，人们构建了多种不同的动物模型。
在生物，医学各方面的研究中，模型生物的建立非常重要。基因敲除技术常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，如人类疾病动物模型。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体，应用基因敲除技术和胚胎干细胞技术制作出来的在个体基因组特定位点上的目的基因被删除或灭活的基因敲除小鼠最具代表性[15]。由于小鼠的基因组改造技术成熟，且生理生化和发育过程和人类相似，基因组和人类90%同源，所以人类疾病的小鼠模型可以基本上真实模拟人类疾病的发病过程及对药物的反应；值得一提的是，人的IL-10与鼠类的IL-10在DNA序列和氨基酸序列上高度同源，所以可以利用小鼠IL-10基因敲除模型模仿人类模型进行研究，小鼠作为遗传学研究材料的另一优势还在于其基因组计划已基本完成。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。且小鼠具有个体差异小、来源充分、无特异性病原菌、成本小、易饲养等优点，方便后续研究。
参考文献：
[1]魏泽辉, 贾存灵, 张智英. CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的应用[J]. 畜牧兽学报, 2014,45(9): 1387-1392
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