开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究意义
脱落酸（abscisicacid，ABA）,其化学名为2-顺式,4-反式-5-(1-羟基-4-氧代-2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基）-3-甲基-2,4-戌二烯酸。结构式见图1。它是一种具有倍半萜结构的植物激素。天然脱落酸是右旋的，其结晶m.p.160-161℃，紫外吸收光谱与溶液的pH值有关，在酸性乙醇中最大吸收峰出现在262nm（ε=21,400）[1]。
图1脱落酸结构式
ABA是经典植物激素之一.在植物的生命周期中起着重要的作用,包括调节植物生长、发育与休眠,调节植物对低温、干旱、盐碱及病原菌等多种逆境的抗性反应。在农业、林业有广泛的应用，促进种子、果实的储藏物质，特别是储藏蛋白和糖分的积累，为农作物的种子的萌发积蓄营养。它是一种种子萌发的完全可逆的有效抑制剂，低浓度的水溶液对植物种子实施简单处理后有利于种子的长期储存。它还可以提高作物抗寒防冻的能力，用于帮助农作物及经济作物抵抗早春期间的低温冻害以及培育新的抗寒力强的作物品种。[2]可以显著提高植物的抗旱力和耐盐碱能力。还有控制花芽分化、调节花期，促进生根的作用，因此单就在农业、林业中脱落酸的应用前景便极为广阔，将为投资方带来数以亿计的直接和间接的经济效益。
同时近来的研究表明,在真菌等微生物、低等的海绵动物和哺乳动物中都发现有ABA的存在和对ABA的反应.多种人与动物组织和细胞在生理条件下或受刺激的条件下能释放ABA，并对免疫细胞、心血管组织与细胞、干细胞和胰腺细胞等有显著的调节作用,被认为是一种生物界广泛存在的通用信号因子,有可能用于多种疾病的治疗。[3]
尽管脱落酸具有良好的植物生理活性及潜在的巨大的生理活性与药用价值，但是就目前的脱落酸生产情况来看，仍远不能普及应用。由于结构上的特殊性，脱落酸的来源一直是世界难题。脱落酸的生产方法可分为3种，一是从植物中提取，大约300公斤脱落的棉铃中可提取9毫克，成本相当高，美国以这种方法生产了少量的脱落酸，售价20多万美元一克。[4]二是人工合成，但人工合成的脱落酸都为内消旋体，其生理活性只有天然脱落酸的一半，每克售价大约160美元，仍然无法大规模应用。第三种就是微生物发酵法生产天然脱落酸，目前每克售价不到1000元人民币，虽然已将成本大幅降低，但是目前仍然没有普及在农业上。[5]所以提高脱落酸产量，降低其生产成本，是使脱落酸广泛应用的前体条件，才能将其的最大限度地服务于我们的生活。
二、国内外研究现状、水平和发展趋势：
ABA的生物合成的研究:
脱落酸生物合成一般有两条途径C15直接途径C40间接途径，前者经C15法尼基焦磷酸直接形成ABA；后者经由类胡萝卜素的裂解间接形成ABA。[6]
图脱落酸生物合成途径
1、高等植物中脱落酸的生物合成
在高等植物中，ABA生物合成一般分为三个阶段：（1）早期反应：小分子磷酸化中间体聚合形成中间反应的前体；（2）中期反应：以非环化的C40类胡萝卜素-八氢番茄红素开始至9-顺紫黄质裂解成黄质醛结束；（3）后期反应：黄质醛作为C15骨架经一系列变化形成ABA。
1）异戊烯基焦磷酸（IPP）的生物合成
IPP生物合成有两个途径，分别在细胞质和质体中进行。细胞质内以甲羟戊酸（MVA）为前体。已知MVA在植物中作为类胡萝卜素及其他一些四萜的前体，但后来发现阻碍MVA合成的甲瓦龙酸素并不影响类胡萝卜素的合成。因而IPP生物合成可能与MVA途径无关。Rohmer等认为IPP生物合成是在叶绿体中以甲基赤鲜糖磷酸（MEP）途径合成的。首先以丙酮酸及硫胺素焦磷酸（TPP）为前体，在3-磷酸甘油醛（GAP）参与下合成5-磷酸脱氧木酮糖，进而在胞苷三磷酸（CTP）参与下形成IPP
2）黄质醛（XAN）的生物合成
无论是细胞质中由MVA合成后进入到质体中的IPP，还是由质体自身合成的IPP都可转化形成XAN。[7]IPP经法呢基焦磷酸（FPP）合成玉米黄质。由于玉米黄质转化形成环氧玉米黄质由环氧玉米黄质环化酶（ZE）催化，紫黄质及新黄质可在9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）作用下氧化裂解形成黄质醛。
3）ABA的合成
由黄质醛生成ABA的过程和部位还有争议。在拟南芥aba3突变体及大豆叶蛋白用丙酮稀释的沉淀物中，黄质醛被醛氧化酶氧化形成黄质醛酸，黄质醛酸很容易转变形成ABA。Lcc等提出高等植物在离体条件下，ABA的合成的最后阶段可能经黄质醛、黄质醛酸、1-4-反式ABA-二醇等中间产物步骤。但其中的一些反应，如4-OH的氧化和1-2-环氧异构化形成1-OH和2-烯等过程还有待进一步研究。番茄突变体flacca和sitiens由于缺乏醛氧化酶不能将2H-ABA醛和2H-ABA醇转化成顺式活性的ABA。ABA醇可在细胞色素P450氧化酶作用下氧化成ABA。黄质醛氧化形成ABA的过程可能经ABA醛阶段在醛氧化酶作用下形成的。因而ABA醛可能是ABA合成的最直接前体。另外Netting等认为ABA加合物也是ABA合成前体。黄质醛究竟通过什么途径转化形成ABA还有待研究确证。
2、真菌中脱落酸的生物合成
至今的研究表明，真菌中脱落酸生物合成途径与植物中脱落酸合成途径是不同的。相关研究者已经对植物病原真菌Botrytiscinerea和一些尾孢属菌中的脱落酸生物合成途径进行了研究，并且推断出来起始于法呢基焦磷酸（FPP）的直接合成途径，然而在不同的物种中发现了不同的中间产物。在Cerosporacruenta中，1,4-dihydroxy-gamma;-ionylideneaceticacid是主要的代谢物，而在C.rosicola中其中间代谢物为1-deoxy-ABA。只有在C.pini-densiflorae和B.cinerea中1-4-trans-diol是主要的ABA前体物质。[8]
三、拟研究的问题
1）类胡萝卜素类前体物质提高ABA发酵产量的研究
2）基于gene-mining的真菌中脱落酸生物合成通路的预测
3）RT-PCR法验证脱落酸合成途径中的酶的表达
四、实验流程
1.Botrytiscinerea液体发酵培养
1）培养基：
斜面培养基：PDA培养基：取去皮土豆200g，切成小块，加水煮沸20min，4层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加入2%琼脂，加水至总体积为1000ml，121℃灭菌25min。
种子培养基：改进PD培养基：取去皮土豆200g，切成小块，加水煮沸20min，4层纱布过滤，加入20g葡萄糖，加水至总体积为1000ml，加入CaCO35g，玉米粉10g，玉米芯粉10g，121℃灭菌25min。
发酵培养基：葡萄糖20g，MgSO47H2O0.2g，KCl0.5g，CaCO35g，KH2PO40.8g，维生素B11mg，谷氨酸单钠盐3.0g，FeSO47H2O0.5mg，ZnSO47H2O2.5mg，CuSO45H2O4mg，加水至1000ml。
2）发酵培养：
斜面培养：将Botrytiscinerea接种于PDA斜面培养基上，置26℃恒温箱中培养3d。
种子培养：挑取1cm2培养好的斜面接种于种子培养基中，在26℃、200r/min条件下培养3d。
发酵培养：将培养好的种子液以5%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中,26℃、200r/min培养8d。
2.脱落酸的提取及含量测定：
1）萃取法提取脱落酸:
取培养好的菌液0.5ml，调节pH值为2.0，加入等体积的乙酸乙酯，充分混合后静置3h，12000r/min离心10min，取上层溶液经过适当稀释后，经高效液相色谱法测定
2）脱落酸含量的测定：
2.1脱落酸标准曲线的制作及其线性范围
取脱落酸对照品约20mg，精密称定，配制成浓度约为2mg/ml的溶液，得到脱落酸对照品储备液。分别精密量取储备液10，50,100,200,400,800，1000mu;l，稀释至1ml，配成一系列浓度的标准溶液。
高效液相色谱法（HPLC）测定：色谱柱为Lichrospher-5-C18，ID5mu;m，2504.6mu;m；色谱柱色谱流动相为甲醇：水：冰醋酸=60：40:0.1；波长：262nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；进样量：5mu;l。取各浓度标准溶液进行HPLC测定，以峰面积对浓度作标准曲线。
2.2含量测定
将脱落酸提取液在线性范围内适当稀释，按照上述的高效液相色谱条件进行测定，根据标准曲线定量。
3.Botrytiscinerea生长曲线制作
利用干重法测定其生长曲线：每隔12小时取发酵液，加入过量稀盐酸溶解碳酸钙。10000rpm，离心10分钟，弃上清液后，80℃烘干至恒重，称量。
4.脱落酸生产曲线制作
每隔24小时对发酵液进行取样0.5ml，调节pH值为酸性（2左右）等体积乙酸乙酯萃取3h，后12000rpm离心10min，取乙酸乙酯相，利用高效液相色谱测定其脱落酸含量。
5.RT-PCR：
5.1Botrytiscinerea总RNA的提取
1）取丝状真菌培养液进行离心，取沉淀于EP管中，称重
2）向离心管中加入1mlTrazol，充分混匀，室温孵育5min，短暂离心，将上清转入干净EP管中
3）加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育3min。
4）10000g，4℃离心15min,此时分三层，上层为无色水相，中间层，下层为粉红色有机相，RNA主要集中在水相。
5)小心吸取上层水相于新EP管中，加入500mu;L异丙醇，室温孵育10min。
6）10000g，4℃离心10min,在管壁和管底形成透明胶状沉淀，去上清。
7）弃上清，室温晾干沉淀（约5min），沉淀溶于50-100mu;LRNA溶解液中
8）55-60℃孵育10min,以打开RNA可能的二级结构
9）保存样品于-70℃以备长期使用。
5.2第一链cDNA的合成
1)加入
|
Components |
Volume |
|
TotalRNA/mRNA |
50ng-5mu;g/5-500ng |
|
AnchoredOligo(dT)18(0.5mu;g/mu;l) |
1mu;l |
|
orRandomPrimer(N9)(0.1mu;g/mu;l) |
1mu;l |
|
orGSP |
2pmol |
|
2TSReactionMix |
10mu;l |
|
TransScriptRT/RIEnzymeMix |
1mu;l |
|
Rnase-freeWaterto |
20mu;l |
2）轻轻混匀
如果用AnchoredOligo(dT)18或基因特异引物（GSP），42℃孵育30min.
如果用RandomPrimer，25℃孵育10min，42℃孵育30min。
3）85℃加热5min失活反转录酶
5.3PCR过程
PCR体系（25mu;L体系）
模板DNA1mu;l
F引物1mu;l
R引物1mu;l
2EasyTaqPCRSuperMix13mu;l
ddH2Oto25mu;l
PCR过程
94℃2-5min
94℃30sec
50-60℃30sec
72℃1-2kb/min
72℃5-10min
(2-4步30-35个循环)
五、实验计划
2013年3月1日2013年3月20日文献研读，引物设计，脱落酸生物合成新途径推测，开题
2013年3月21日2013年4月20日液态发酵脱落酸含量测定及生长曲线测定，类胡萝卜素类物质对脱落酸产量影响研究
2013年4月21日2013年5月20日RT-PCR法验证脱落酸生物合成新途径
2013年5月21日2013年5月31日撰写论文，结题
六、参考文献
[1]WEEDONBCL,MOSSGP.Structureandnomenclatureofcarotenoids[J].Purw.Appl.Chem.,1995,41:407-413.
[2]OLSONJA.Provitamin-Afunctionofcarotenoids:theconversionofbeta;-carotenoidintovitamin-A[J].J.Nutr.,1989,119:94-95.
[3]BARTLEYGE,SCOLNIKPA.Plantcarotenoids:pigmentsforphotoprotection,visualattraction,andhumanhealth[J].PlantCell,1995,7(7):1027-1038.
[4]TRACEWELLCA,VRETTOSJS,BAUTISTAJA,FRANKHA,BRUDVIGGW.CarotenoidphotooxidationinphotosystemⅡ[J].ArchBiochem.Biophy.,2001,385(1):61-69.
[5]ZHUCHF(朱长甫),CHENGX(陈星),etal.Carotenoidbiosynthesisinplantsandapplicationofitsrelativegenesinfeneengineering[J].JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology(植物生理与分子生物学学报),2004,30(6):609-618(inChinese).
[6]WANGWJ(王伟杰),XUCHJ(徐昌杰).Naturalcarotenoidbiosynthesisandbiotechnologicalapplications[J].JournalofCellBiology(细胞生物学杂志),2006,28(6):839-843(inChinese).
[7]WINTERHALTP,SCHREIERP.Thegenerationofnorisopernoidvolatilesinstarfruit(AverrhoacarambolaL.):areview[J].FoodRev.Int.,1995,11:237-254.
[8]ROCKCD,ZEEVAARTJA.TheabamutantofArabidopsisthalianaisimpairedinepoxy-carotenoidbiosynthesis[J].Proc.Natl.Acad.Sci.,1991,88(17):7496-7499.
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究意义
脱落酸（abscisicacid，ABA）,其化学名为2-顺式,4-反式-5-(1-羟基-4-氧代-2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基）-3-甲基-2,4-戌二烯酸。结构式见图1。它是一种具有倍半萜结构的植物激素。天然脱落酸是右旋的，其结晶m.p.160-161℃，紫外吸收光谱与溶液的pH值有关，在酸性乙醇中最大吸收峰出现在262nm（ε=21,400）[1]。
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