- 课题解决的问题
实验室前期通过构建nosO基因敲除菌，构建了线性未成环的诺西肽中间体，后续进行了诺西肽中间体的发酵工艺研究，从而获得了大量纯化的诺西肽中间体iM。本次课题将对中间体iM进行体外生物转化的研究，验证中间体iM可以通过狄尔斯阿尔德反应生成诺西肽。本课题以诺西肽中间体为体外反应的底物，以nosO表达菌破菌上清进行回补，混合nosO敲除菌破菌上清进行全菌催化，通过分析体外转化生成的产物，从而探讨诺西肽吡啶环的生物合成形成机制.
- 研究方法和技术路线
本研究拟采用的研究手段：无菌操作技术、菌落培养技术、菌体破碎技术、体外生物转化技术、高效液相检测技术、数据处理和分析。通过上述有关的研究技术对诺西肽合成中间体iM的发酵工艺进行研究，研究技术路线如下图所示：
三、文献综述
诺西肽又称那西肽,是一类富含硫元素并且含多个噻唑环的硫肽肽类抗生素[[1]],硫肽类抗生素是一类来源于微生物,富含元素硫,结构被高度修饰的聚肽类天然产物[[2]],具有良好的抗菌活性,其中部分成员对多种耐药性的条件致病菌具有极强的杀伤效果[[3]],诺西肽作为硫肽类抗生素中唯一成药的两种抗生素之一，而且诺西肽是硫肽类抗生素家族中结构较简单的化合物，其类似物诺卡沙星I具有潜在的成药价值（但是其产生菌不能进行遗传操作）[[4]]，所以，诺西肽已成为硫肽类抗生素生物合成途径研究的模式抗生素。通过研究和解析诺西肽的生物合成，可以深入理解硫肽类抗生素的生物合成机制，包括生物合成的共性与特性问题，为加快硫肽类抗生素的开发提供理论依据。
诺西肽主要由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)产生,适合于抑制肠道内革兰氏阳性细菌的生长,是一种非吸收型环保动物饲料添加剂[[5]]. 那西肽能阻碍细菌的蛋白质合成，低浓度时抑菌，最低抑菌浓度(MIC)平均为0.008ug/ml[[6]],高浓度时杀菌；它通过阻抑有害细菌的生长，恢复肠道管壁吸收机能，来促进动物生长、提高饲料效率[[7]], Mocek-U通过2D-NMR测定那西肽的氢谱和碳谱[[8]]，确定了其结构和构型：分子中带有5个噻唑环（Thz），1个吲哚环(Ind)，1个吡啶环(Pyr)，1个苏氨酸(Thr)，1个谷氨酸(Glu)，侧链是一个脱氢丙氨酸(Deala)。其结构如图1所示。
2009年，中科院上海有机所刘文教授课题组采用DNA探针筛选基因文库钓取生物合成基因簇的策略[[9]]，并在GenBank公开了诺西肽生物合成基因簇全部序列,并且公布了其翻译后修饰的阶段:（1）核心大环形成前的PTMs；（2）核心大环的形成；（3）核心大环形成后特异的PTMs。其中核心吡啶环是硫肽类抗生素最具典型的特征[[10]]，但其机制仍然无法解释。现在主流的观点是一种Diels-Alderase假说：诺西肽核心吡啶环的形成过程中，可能存在一种“Diels-Alderase”负责[4 2]环加成反应[[11]]，进而形成吡啶环自然界中已报道有5个纯化的酶能够参与Diels-Alder反应，通过产物v鉴定可以确定这5种酶可以指导Diels-Alder反应，但是这些酶催化的可能不止一步反应，导致关于环加成步骤的催化反应的特异性不是很清楚。在硫肽类的吡啶环形成机制研究中，美国科学院院士Walsh CT教授课题组首先在研究高硫青霉素的生物合成过程时发现[[12]]，将tclM基因失活可以得到一系列的线状中间体，并依此推测TclM可能负责[4 2]环加成反应形成吡啶环，但是目前吡啶环形成这一步的生物合成体外重现还没有能够完成.
生物合成体外转化[[13]]，是一种在体外进行的，利用体外表达生物合成所需酶或蛋白，回补到中间产物的体外催化体系中，重新完成原本在生物体内进行的生物合成途径的研究方法。这种方法可用来定性生物合成途径中特定酶所起的独特功能，也可用来鉴定合成途径中的中间体[[14]]。因此，这一步的未实现使得吡啶环的形成机制并没有得到完整的阐述，从而阻碍了其应用于硫肽类抗生素的组合生物合成[[15]]。
因此，本次课题将对诺西肽中间体iM进行体外生物转化的研究，验证中间体iM可以通过狄尔斯阿尔德反应生成诺西肽。本课题以诺西肽中间体为体外反应的底物，以nosO表达菌破菌上清进行回补，混合nosO敲除菌破菌上清进行全菌催化，通过分析体外转化生成的产物，从而分析外反应的反应机制。并以这个反应机理为基础，进而探讨诺西肽吡啶环的生物合成形成机制。
四,参考文献:
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