实验背景
测定肝细胞增殖抑制的常见方法主要是MTT比色法，但MTT法不仅检测步骤复杂，而且由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，因此实验结果也不准确。此外，溶解甲瓒的有机溶剂具有致癌性，对实验者也有损害。流式细胞术是通过研究荧光标记的单细胞或其它生物粒子的生物学功能特征，根据设定散射光和多种荧光参数，对待测样本进行数据采集，实现高速分选和准确定量分析，最适宜定量分析悬浮细胞的形态与功能，具有速度快、精度高、准确性好等优点，是目前研究细胞生命活动最常用的技术方法之一。近年来，随着流式细胞术的不断发展以及Cyclin/DNA分析方法的形成，为成为新的、更科学的细胞增殖分析方法奠定了基础。
细胞周期蛋白或周期素（Cyclin）周期性积累与降解对细胞周期的进程起关键作用。不同的细胞周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同。在哺乳动物细胞中，周期蛋白A在G1期的早期即开始表达和逐渐积累，到达G1/S交界处，含量达到最大值并一直维持到G2/M期。周期蛋白B则从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期的中期阶段，然后迅速降解。作为G1期周期蛋白的周期蛋白D在细胞周期中持续表达，而周期蛋白E则在M期的晚期和G1期早期开始表达并逐渐积累，到达G1期的晚期，其含量达到最大值，然后逐渐下降直到G2期的晚期。因此，在细胞未进入S期时，可应用Cyclin E或Cyclin D作为细胞增殖的标志；当在细胞进入S期后，则可应用Cyclin B1和Cyclin E作为细胞增殖的标志。因此，Cyclins / DN A双参数流式细胞术与目前较为常用的DN A含量法、较为先进的Ki-67 / DN A双参数流式细胞术相比, 更为完整地显示出细胞增殖部分, 更为敏感地检出早期的细胞增殖部分, 同时该方法也具备更充分的细胞生物学基础和意义。
实验的目的和意义
本实验旨在应用流式细胞术和Cyclin/DNA双参数法建立一种快速、灵敏、可靠、简单的能准确测定肝细胞增殖抑制的方法，为抗肿瘤药的研究提供技术保障。
实验内容
1. 细胞培养：取对数生长期HEPG2细胞，接种至24孔板，每孔1x10^5细胞，放入CO2培养箱培养24h。
2. 给药方法：弃去培养液，按不同浓度药物设4个组，分别加入异烟肼浓度为15、30、40、60 mmol/L的培养液。空白对照组加入新鲜培养液，阳性对照组加入1umol/L的紫杉醇。每组三个附孔。加药后继续在CO2培养箱培养24h。
3. 细胞的处理：收获1x10^6个细胞，悬浮于80%冷乙醇中，置-20C冰箱中过夜。用PBS洗涤2次，4C，500gx5min。将细胞悬浮于2.5g/L TritionX-100中，冰浴5min。PBS洗涤2次，4C，500gx5min。加入100ul用10g/L的BSA稀释的抗Cyclin E B1单克隆抗体（0.25ug/10^6细胞），4C孵育过夜。
4. 染色：PBS洗涤一次，4C，500gx5min；加入100ulFITC标记的二抗（用10g/L的BSA按稀释度稀释），室温孵育30min。PBS洗涤一次，4C，500gx5min；细胞悬浮于300ul的10mg/L的PI和1.0g/L的Rnase中，室温避光染色20min。
