开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究的主要目的和意义
铂类药物是临床上普遍使用的广谱抗肿瘤药。据统计，在接受肿瘤化疗的病人中，约有40-80%是通过铂类药物以及与其他药物的联合使用来进行治疗的[10]。然而，由于其固有的或首次用药后快速获得的多药耐药性的存在，使它的有效性大大减弱，限制了其在临床的进一步应用，因此亟待新技术解决此问题。
RNA干扰技术的发现为克服耐药性提供了新途径，它可通过构建特定的siRNA沉默耐药相关基因，增强肿瘤细胞对化疗物质敏感性，逆转肿瘤的顺铂耐药性。研究发现Bcl-2是一种与肿瘤发生以及耐药相关的凋亡抑制基因，在许多肿瘤细胞上都有过表达，已有实验表明Bcl-2的过表达可延迟触发化疗药物诱导的细胞凋亡，所以通过递送siBcl-2下调Bcl-2的表达水平，可增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。
然而，裸露的siRNA因其本身阴离子和大分子的特性，不能轻易地穿透细胞膜，还有可能被内源性酶降解，无法达到有效的治疗浓度[6]。因此，为将足量siRNA成功递送至细胞内需开发安全有效的载体。与此同时，化疗药物的递送方式对药效的发挥也有重要影响。最近有研究探索了利用一系列纳米载体平台联合递送化疗药物与siRNA的可能性。其中一个最早用于癌症治疗的研究范例通过使用含特定siRNA的微细胞和紧随其后的载药微细胞，有效克服了肿瘤耐药性，提高了肿瘤生长抑制效果[7]。然而，为产生最佳的协同作用，siRNA和药物应同时进入肿瘤细胞。纳米载体平台能实现siRNA与药物至肿瘤细胞的共递送，被认为是肿瘤治疗中极具潜力的研究方向[8]。
同时，顺铂前药聚合物纳米粒的制备也是克服顺铂耐药性的可行方法之一。细胞对顺铂的敏感性与一系列细胞内过程有关。顺铂在铜转运蛋白（Ctr1）协助下摄取进入细胞，而在顺铂耐药细胞上，Ctr1表达水平极低[4]。富含硫醇基的金属硫蛋白（MT）可以和包括二价铂在内的许多金属离子紧密结合。MT正是通过这种与重金属物质的螯合作用实现了细胞内药物的解毒，伴随着细胞内MT蛋白含量增加，顺铂疗效也因此降低[5]。此外，DNA修复蛋白，外排蛋白也都会引起药效的减弱，导致顺铂耐药性的发生。本研究通过顺铂前药聚合物和siRNA静电复合形成纳米粒，改变药物摄取方式，不再依赖Ctr1而是通过内吞方式将药物递送至细胞内，药物的摄取量将大大增加。此外，纳米粒与细胞内蛋白的反应活性以及与DNA的结合模式都较顺铂发生改变。这些差别都将使复合物纳米粒在耐药细胞上显示优越疗效[9]。
本研究期望通过制备运载siBcl-2的顺铂前药复合物纳米粒，实现siRNA和抗肿瘤药物的共递送，以产生协同作用，克服肿瘤细胞耐药性，提高肿瘤治疗效果。
- 研究方法和技术路线及文献综述
- 研究方法和技术路线
- 顺铂前药聚合物的制备及纯化
通过查找文献，收集资料，确定合成方法和条件；控制单一变量，确定最佳投料比。聚乙烯亚胺（PEI）是已被深入研究的阳离子基因载体，具有生物相容性和较好的转染能力，结构中含有多个氨基，可与含双羧基的顺铂前药发生共价结合，形成含酰胺键的前药聚合物。筛选合适分子量与结构的PEI、催化体系，反应温度和时间，以合成一定分子量范围内的聚合物。合成后的产物置于截留分子量为3500Da的透析袋中，在1% Na2CO3中透析一段时间后，换用纯化水持续透析两三天，出去未反应的原料及低分子量的副产物。最终产物置于-80度冰箱预冻，冻干机冻干后，干燥塔中避光保存。
- 顺铂前药聚合物结构的确证以及合成产物的物理化学表征
2.1 结构确证：顺铂前药的羧基与PEI的胺基形成酰胺键结构，分别对顺铂前药、PEI、合成聚合物的结构进行核磁检测。
2.2 粒径、电位表征：顺铂前药聚合物与siRNA通过静电作用形成纳米粒后，通过激光粒度仪测定其粒径及电位。粒径小于150nm则可通过网格蛋白介导内吞进入细胞，电位的高低反映制备纳米粒的稳定性。
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